對于所有形式的色譜法，都存在與樣品負載相關(guān)的限制——質(zhì)量和體積。這些是自變量，為了獲得zui佳結(jié)果，應單獨調(diào)查。在這篇文章中，我將討論增加溶劑體積對快速色譜分離的影響。

確定zui大加載體積的一個相關(guān)且關(guān)鍵的變量是溶解溶劑（樣品溶劑）的選擇。如果溶劑強度太高，則會導致峰變寬，并zui終導致產(chǎn)品損失，因為某些樣品會以 1 CV 與樣品溶劑一起洗脫。

正如之前的帖子中提到的，在可能的情況下，zui大限度地提高樣品濃度溶解溶劑中 ，以zui大限度地提高分離性能。

為了幫助說明溶解溶劑和進樣體積的作用，我將展示溶解在兩種不同溶劑，甲醇 (MeOH) 和二甲亞砜 (DMSO) 中的反應混合物的純化數(shù)據(jù)。

馬尿酸 (~0.5 g) 和 α-甲基芐胺 (~0.4 g) 在乙酸乙酯 (EtOAc) 中在 200 °C 下反應 10 分鐘，使用 Biotage Initiator+ 微波合成儀進行兩次。合成后，我將每個反應轉(zhuǎn)移到自己的 20 mL 閃爍瓶中，并使用 Biotage V-10 Touch 蒸發(fā)掉 EtOAc。

反應1產(chǎn)生932.5毫克，而反應2產(chǎn)生的總質(zhì)量為 942.5 毫克。將反應1溶解在 MeOH 中至體積為5mL，而將反應2溶解在相同總體積的 DMSO 中。選擇這些溶劑是因為它們提供了完全的反應混合物溶解度。

在本研究中，我在Biotage Isolera Dalton 2000 上使用了 12 克 Biotage Sfar C18 色譜柱。12 克C18 色譜柱的柱體積 (CV) 為 17 mL。注射量需要根據(jù)CV的百分比來考慮，并應保持盡可能小。我選擇道爾頓2000系統(tǒng)是因為它能夠確定是否有任何反應混合物組分與溶解溶劑一起洗脫，這是體積過載的明顯跡象。

第1個測試使用了一個小的0.1mL上樣量 (~18.75 mg)，相當于色譜柱體積的0.6%。使用這個小體積，兩個樣品提供了相同的色譜，圖 1。

圖 1. 上樣量為 0.1 mL (0.6% CV) 的反應混合物純化溶解溶劑的色譜比較。頂部 - MeOH 溶解的反應混合物。底部 - DMSO 溶解的反應混合物。

測試二將進樣體積增加到0.5mL (~93.75 mg)，等于色譜柱體積的 2.9%。在這里，我們可以看到甲醇樣品的峰開始變寬，但仍能提供出色的分離效果，圖 2。

圖 2. 上樣量為0.5mL (2.9%) 的反應混合物純化的比較。頂部 - MeOH 溶劑化反應混合物。底部 - DMSO 溶劑化反應混合物。

在zui后一次測試中，進樣量加倍至1mL (~187.5 mg)。在此體積下，即色譜柱體積的 5.9%，甲醇樣品顯示出較大的分離度損失，這是由于較寬的峰以及在溶劑前沿洗脫的產(chǎn)物。然而，DMSO 樣品仍然產(chǎn)生了出色的分離效果，沒有產(chǎn)物與 DMSO 峰一起洗脫，并且有進一步增加負載的空間，圖 3。

圖3. 1mL上樣體積（CV 的 5.9%）的色譜比較。頂部 - MeOH 溶劑化反應混合物，其中可以看到樣品穿透以及峰變寬和分辨率損失。底部 - DMSO 溶劑化反應混合物顯示沒有突破和完全分辨率。

如您所見，樣品溶劑的選擇對純化質(zhì)量有重大影響。雖然甲醇的極性相當大 ( log P -0.77 )，但它是梯度中的強溶劑，限制了其加載體積范圍。另一方面，DMSO 極性很強（ log P -2.03 )并且是一種非常好的溶劑，DMF 也是一種極好的溶解溶劑選擇。 DMSO 廣泛的溶劑化特性和非常高的極性使其成為我想要zui大限度地提高負載和純化通量時的反相溶解溶劑的選擇。

如果您使用甲醇，甚至乙腈作為樣品溶劑，請將體積保持在色譜柱體積的 3% 以下。如果您將樣品溶解在 DMSO 中，您可以合理地期望在保持分離的同時至少將進樣體積和質(zhì)量負載增加一倍。